1. Author
James E. Crowe, Jr.
James E. Crowe,Jr.实验室研究重点是人类B细胞对病毒产生有效反应的分子和结构基础。同时，在生物防御研究、疫苗和单克隆抗体开发以及生物技术方面也有积极的项目。前的研究集中在埃博拉和马尔堡病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、流感、登革热病毒、艾滋病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、轮状病毒和诺如病毒、狂犬病、裂谷热病毒、西尼罗河病毒和牛痘病毒/猴痘/天花。我们还对人类抗体对包括百日咳和金黄色葡萄球菌在内的细菌毒素的反应进行了新的研究。
James E. Crowe,Jr.团队研究期间开发的许多候选疫苗和人类单克隆抗体已在I-III期人体临床试验中进行了测试，包括获得EUA或美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局全面批准的tixagevimab+cilgavimab（Evusheld），用于预防新冠肺炎，在美国、欧洲、中东、非洲和澳大利亚为患者提供了超过300万次治疗。
2. Background
2.1丙氨酸扫描突变
在分子生物学中，丙氨酸扫描是一种定点诱变技术，用于确定特定残基对特定蛋白质稳定性或功能的贡献。使用丙氨酸是因为它与其他氨基酸的二级结构偏好相同，同时具有低体积、化学惰性的甲基官能团。当需要保留突变残基的大小时，有时会使用缬氨酸和亮氨酸。该技术还可用于确定特定残基的侧链是否在生物活性中起重要作用——通常通过定点诱变或通过创建 PCR 文库随机完成。此外，已经开发出计算方法来根据丙氨酸取代估计热力学参数。一项关于上皮钠通道 (ENaC) 表面保守带电残基作用的系统研究使用丙氨酸扫描来揭示带电残基在蛋白质转运至细胞表面的过程中的重要性。
3. Methods
1. 单克隆抗体的表达与纯化
2. ELISA结合实验
3. 血浆抗体竞争性结合实验
4. 蚀斑减少中和试验（FNRT）
5. 实时细胞分析中和实验
6. 前/后接触中和实验
7. 接触抑制实验
8. 人源ACE2结合抑制实验
9. 冷冻电镜负染实验
10. 丙氨酸扫描突变确定抗体结合表位图谱
11. VSV构建S突变株，确定逃逸位点
12. 肺部免疫组化
13. 小鼠保护实验
4. Results
实验团队从新冠患者体内得到了389株抗体，其中COV2-2676与COV2-2489为非RBD靶向，但具有一定中和能力的抗体。这两个抗体与S6P存在着弱结合，但是与可溶性NTD不发生反应。COV2-2263 和COV2-2490虽然没有中和作用，但是与S6P和可溶性NTD都有一定的结合能力。后续利用了VSV假毒中和以及WT真毒实验测定了这些抗体的中和能力。在表位竞争实验中发现COV2-2676与COV2-2489的表位相同，并且与之前报道的NTD抗体都不相同。
非RBD靶向的新冠抗体
因为COV2-2676与COV2-2489优异的中和能力，将其确立为主要的研究对象，利用冷冻电镜与负染的方法，探究两个抗体具体的结合表位。发现二者结合“关闭”状态下的NTD段。有趣的是实验团队发现与之前中和能力可观的抗体4A8和4-8相比，这些抗体的结合表位都包括了N3-N5 loop。后续利用丙氨酸扫描技术，确定了NTD中A123, G142, Y144, F157和N164为关键结合表位；VSV突变逃逸实验确定了NTD中F140S,G142D,R158S为关键的中和表位。
NTD中关键的结合与中和位点
众所周知，NTD的抗体可以与已被感染的细胞结合进而清除病原体。实验团队利用流式细胞术的方法，来测定COV2-2676与COV2-2489与感染细胞的结合能力。实验发现虽然在绝对数值方面，COV2-2676与COV2-2489不如RBD抗体，但是就结合效率远高于RBD抗体。同时COV2-2676与COV2-2489的结合表现出细胞类型依赖性，对VeroE6的亲和力最好。除此之外实验团队还发现，单纯的Fab段的COV2-2676与COV2-2489不能够发挥中和效应，具体的机制尚不清楚，实验团队推测可能是需要Fc的空间效应才能够发挥中和的作用。
在个体水平进行的小鼠实验发现，无论是预防还是治疗，COV2-2676与COV2-2489都拥有良好的保护功能。后续的Fc功能验证实验也发现，当RBD与NTD抗体连用时，保护效果更佳。
COV2-2676与COV2-2489有良好的体内保护效果
5. Discussion
作者： Naveenchandra Suryadevara
通讯作者：James E. Crowe, Jr.
单位：Vanderbilt Vaccine Center, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA
年份：2021.4.29
期刊：Cell
科学问题 ：非RBD靶向的抗体（NTD）发挥功能的方式是什么
结论：实验团队通过血清学与分子生物学等手段分离鉴定了有别于4A8/4-8的NTD抗体——COV2-2676和COV2-2489。这两个NTD抗体通过抑制感染的post-attachment阶段进而阻止病毒的进入与融合。同时，COV2-2676和COV2-2489的Fab 形式失去了中和活性，这可能表明阻断是通过 Fc 段向 RBD 方向投射的空间效应间接发生的（MERS-CoV mAB 7D10 的情况一样）。后续通过丙氨酸扫描手段，确定了NTD的关键中和部位：F140S/G142D/R158S。实验团队同时还提出这类抗体可能还通过Fc段效应功能来帮助机体抵御病毒侵袭。这为疫苗设计提供了新思路：RBD+NTD的新模式。
Graphical abstract
