期刊：Cancer Cell

影响因子：50.3

学习Cancer Cell文章研究思路——单细胞转录组和空间蛋白组助力临床三阴性乳腺癌亚型和治疗轨迹

研究背景

在乳腺癌中，缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子2蛋白表达的三阴性乳腺癌亚型（TNBC）是最具免疫应答性的亚型，也是唯一将免疫检查点抑制(ICI)作为标准治疗的亚型。然而，在转移性的TNBC中单药治疗的有效缓解率也只有20%。因此，在此后的TNBC治疗中应该将重点研究方向转移到ICI联合RT的治疗中。

本研究使用单细胞转录组学和空间蛋白质组学技术分析了在基线（baseline）、一个周期的派姆单抗（pembro，PD-1）和第二个周期的派姆单抗联合放疗（RTPD1）治疗后的三阴性乳腺癌（TNBC）穿刺活检的响应情况。发现无响应组在治疗前后缺乏免疫浸润；有响应组通过分类器计算分为两组，其中一组表现出高的主要组织相容性复合物（MHC）表达和三级淋巴结构特征，并且在治疗前表现出抗肿瘤免疫；另一响应组与基线时的无响应组相似，只有在联合治疗后才产生最强的免疫应答，并伴有细胞毒性T细胞和抗原呈递髓系细胞的相互作用。该研究结果在TNBC的小鼠模型中进行了验证。

研究思路

治疗路线

该研究设计并执行了一项新辅助临床单臂试验（NCT0336684450），50例完整可评估的患者术前接受派姆单抗治疗，一个疗程（3周/疗程）后对原发乳腺肿瘤进行派母单抗联合RT治疗，然后继续进行标准治疗化疗，手术切除和RT治疗。超声引导下的活检穿刺分别在第1周期前、第1周期后、第二周期后（局灶RT后）3周进行。穿刺活检样本进行scRNA-seq，手术切除确定是否病理完全缓解（pCR），其中CD45+样本同时进行TCR/BCR-seq。在34例有完整可评估活检的患者中，23例（67.6%）对治疗有响应，17例pCR显示残留癌负担(RCB)评分为0（17/23），或乳腺癌病理学家在手术时评估的残留病极小，RCB评分为1（6/23）。本研究分析了34例scRNA-seq患者的514,495个细胞和来自27例CODEX患者的540万个细胞。

分组方式

1.按照治疗时间顺序分组：

base：基线组

PD1：派母单抗治疗组

RTPD1：派母单抗联合PD1治疗组

2. 按照治疗效果有无响应分组：

R：响应组

NR：无响应分组

3. 根据Codex聚类分组（有无响应）：

R1,R2,NR

研究结果

1. 运用空间蛋白分析技术划定TNBC中的细胞社群

运用Codex多重免疫荧光染色（marker：CD20、CD3e、CD68、PANCK，图2B，原理类似非因单细胞空间蛋白分析技术）进行细胞类型注释（图2C），并使用无偏机器学习算法进行空间区域分析，将空间区域划分为12个区域（d0-d11，图2D），发现d3区和d4区以淋巴细胞为主，d3含CD4T和CD8T细胞最多，d4区含B细胞最多。d6区为混合物社区，d9区以髓系细胞为主（78%）。d8区以浆细胞为主。

2. 治疗诱导应答性TNBC免疫微环境的重塑

研究继续对穿刺样本Codex染色数据进行相对细胞比例（占总细胞的百分比）和细胞密度（单位面积细胞数）的研究。发现响应组中细胞密度更高，CD8+T和B细胞比例更高。经过RTPD1治疗后响应组的总免疫细胞比例增加（通过上皮细胞损失，和增加CD8+ T和浆细胞密度）。免疫区d3、d6、d8和d9仅在RTPD1的响应样本中比例增加，d3和d6的比例和密度高于RTPD1的无响应样本。治疗前，d4是唯一与响应相关的区；RTPD1治疗后响应组的免疫富集区（d3、d4、d6、d8和d9）均按比例和密度富集。

3. 单细胞RNA序列分析的时间过程活检

通过scRNA-seq技术鉴定了342,749个CD45+细胞，Leiden聚类鉴定出各细胞类型（图4A），对B细胞/浆细胞、T细胞和髓细胞进行亚组分析，并使用进行差异基因表达分析（DGEA）。用CellTypist将B细胞分为sc-b0至sc-b8亚型，T细胞分为sc-t0至sc-t7亚型，将髓系细胞分为sc-m0至sc-m11亚型（图4B-D）。在B/浆细胞中，sc-b0、sc-b2和sc-b8与响应相关，而sc-t5和sc-m7分别与T细胞和髓细胞区室的响应相关（图4H）。响应组在PD1治疗后sc-t4和sc-t6积累，RTPD1后sc-t6进一步增加（图4I）。在有响应的髓细胞中，sc-m3、sc-m5和sc-m6在整个治疗过程中下降，而sc-m11在RTPD1后升高。此外，研究者还分析了CODEX分组和scRNA-seq集群之间的一致性。scRNA-seq T细胞丰度与T细胞富集区d3、d6和d9相关。效应T细胞亚群sc-t4和sc-t6与T细胞区d3、d6、d8和d9的相关性强于其他T细胞亚群。值得注意的是，sc-t2与d4相关，证明了naive-T细胞与B细胞的共定位。DC亚群sc-m7和sc-m8也与包含d3、d4、d6和d8区的B细胞和T细胞相关。有趣的是，与效应T细胞相关的d8和d9也与抗原呈递巨噬细胞（sc-m11）相关。

4. 效应T细胞扩增与抗原呈递巨噬细胞相关 

观察新抗原反应效应CD8+ T细胞（“neoTCR8”）特征，在sc-t4和sc-t6组中表现出最高的表达水平（图5A）。在T细胞空间分布方面，RTPD1治疗后响应组在上皮细胞附近有更多的T细胞，并且有更多的上皮细胞直接与T细胞相邻。在与T细胞扩增的区域相关性方面，d3和d6密度与sc-t4和sc-t6扩增呈正相关，d8和d9具有最大的相关性，这些相关性是由PD1和RTPD1治疗驱动的（图5F）。为了检验d8和d9与效应扩展相关的原因，作者研究了区域间的空间相关性（图5G和5H）。研究发现，d8区与其他区无空间联系，而d9区与d3区和d6区均有空间联系。值得注意的是，d9含有表达抗原加工和递呈标记的骨髓细胞，这些标记也区分了与效应扩增相关的sc-m11巨噬细胞（图5I）。这些区域间的空间相关性在响应组和无响应组之间没有差异。

5. 具有不同免疫轨迹的两个响应亚型

为了研究肿瘤在空间对响应的异质性表现，根据CODEX不同区域的表达情况进行了无偏聚类分析（图6A）。聚集分为三组，大多数无响应的肿瘤形成一个亚组（NR），响应的肿瘤形成两个亚组（R1，R2）。治疗前，R1的总细胞密度显著高于R2和NR（图6B）；在R1中，上皮细胞在PD1治疗后明显丢失，而在R2中只有在联合治疗后才出现；免疫细胞也具有不同的表现：R1开始具有较高的免疫细胞密度，但在每次治疗后这种测量值下降，R2仅在RTPD1治疗后才看到免疫细胞增加（图6C）。在空间定位方面，在整个治疗过程中，R1中的上皮细胞在其附近保持恒定的T细胞密度，而R2在RTPD1治疗后增加（图6H）。与d4富集一致，在基线和PD-1治疗后，R1中B细胞比R2中多（图6I），然而，这种差异通过RTPD1治疗后R1中B细胞密度的减少而减少。

6. TNBC小鼠模型验证

单臂临床试验的性质使该研究无法将RTPD1后观察到的免疫变化完全归因于来自RT治疗还是延迟的PD1治疗，因此研究者利用E0771 TNBC原位小鼠模型直接研究了RT对肿瘤微环境的影响。分别进行了一项四组生存研究，小鼠接受局灶性放疗或不接受放疗，同时给予IgG（对照组）或PD1治疗。单一RT治疗和PD1治疗均可适度影响肿瘤生长，90天以上生存率为20-30%。然而，RTPD1联合治疗可使肿瘤完全消退，生存率达到100%。此外，研究还发现RT治疗无论是作为单一治疗还是与PD1联合治疗，都能促进CD8+ T细胞终端分化基因信号，并将CD4+ T细胞从静止状态转化为激活状态，并伴随C1qhi/MHCIIhi巨噬细胞的增加，而PD1治疗则不能。此外，R2轨迹与典型的ICI响应并不一致。研究发现R1中的骨髓细胞、巨噬细胞和DCs与R2相比具有更高的PD-L1表达。在巨噬细胞中，这种差异是由sc-m2和sc-m11驱动的，而在DCs中，这种差异是由sc-m7和sc-m9驱动的。

总结

该研究表明通过多重免疫蛋白染色数据将TNBC分为三个响应轨迹。其中，R1轨迹在派姆单抗治疗后表现出最强的T细胞反应，伴随上皮细胞和B细胞的消退，在使用RT联合治疗后并没有变化。而R2轨迹在基线时与NR的区分并不显著，R2是在联合治疗后才表现出强烈的免疫应答，而NR在治疗后完全没有反应。此外，RT和抗pd -1单药治疗对生存率的影响较小，然而，联合治疗使肿瘤完全根除。PD1治疗适度地增加了活化的CD8+ T细胞，而RT治疗在CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中都使得活化基因增加，而通过联合治疗使活化基因增加被显著放大。