文献阅读：利用液滴条形码测序技术对单个细胞外囊泡进行蛋白质分析，行业新闻

文献阅读：利用液滴条形码测序技术对单个细胞外囊泡进行蛋白质分析

2024-01-17 19:53 浏览:922 搜索引擎搜索“手机财发网”
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文献信息

标题：Characterizing single extracellular vesicles by droplet barcode sequencing for protein analysis

DOI(url): https://isevjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12277

日期及杂志：2022 Nov, J Extracell Vesicles

作者及单位：Mahsan Banijamali

文献概述(这篇文献的结论是什么？)

近年来，小细胞外囊泡(Small extracellular vesicles, sEV)已发展成为疾病诊断和治疗随访的生物标志物来源。来自多细胞生物的sEV样品显示出高度异质性的囊泡库，这是目前基于集成测量的方法无法捕获的。在这项工作中，我们提出了用于蛋白质分析的液滴条形码测序(DBS-Pro)来分析单个sEV的表面蛋白，从而促进样品内和样品间sEV亚型的鉴定。该方法允许通过使用DNA条形码亲和试剂和测序作为readout分析多种蛋白质。高通量单囊泡分析是通过在乳化液液滴中对单个sEV进行区隔，然后通过PCR对液滴进行条形码分析实现的。在这个概念验证研究中，我们证明了DBS-Pro允许分析单个sEV，混合率低于2%。从非小细胞肺癌细胞系和非小细胞肺癌患者的恶性胸腔积液(MPE)液中获得的总共超过120,000个sEV根据其表面蛋白进行了分析。该方法实现了单囊泡表面蛋白图谱和sev亚型的扩展表征，这对于在异质样本中识别囊泡的细胞起源至关重要。

文献结果(每个结果的图片详细解读)

1、蛋白分析液滴条形码测序(DBS-Pro)法原理

图1描述了用于蛋白质分析的液滴条形码测序(DBS-Pro)的概念，以及sEV在单囊泡分辨率下的定量蛋白质分析。囊泡用含有抗体特异性条形码(antibody-specific barcode, ABC)和UMI的寡核苷酸偶联抗体进行标记。用霍乱毒素亚基B (CTB)覆盖的磁珠捕获带有抗体标记的囊泡，进行洗涤，然后被封装在含有独特的液滴条形码(DBC)序列的乳化液液滴中。在每个液滴中，ABC和DBC通过重叠延伸被放大和连接。对所得文库进行测序，并对单个囊泡的表面蛋白进行鉴定和定量。

Fig1

2、单囊泡检测的验证

为了研究和验证DBS-Pro法对单个囊泡的检测(图1)，本文使用从NSCLC细胞系H1975的细胞培养基中收集的sEV进行了一系列hashing experiments(图2A)。两组不同的条形码寡核苷酸被用来标记CD9和EGFR抗体。在bead hashing中，囊泡与两组在不同的反应管中孵育，并分别捕获，并在形成液滴之前混合。在EV hashing中，囊泡与两组在不同的反应管中孵育，但在它们被捕获之前进行混合。(图2B)显示了bead hashing(n = 2)和EV hashing(n = 3)的Single set和混合速率。如果95%或更多的UMI只属于一个集的ABC，则认为液滴是Single set的。(图2C)显示基于每个单个囊泡的UMI计数的Single set和混合液滴。hashing experiments清楚地表明，DBS-Pro在至少98%的液滴中以单个囊泡分辨率生成数据。

Fig2

3、DBS-Pro用于非小细胞肺癌细胞系sEV多重蛋白分析的验证

为了研究该技术分析单个sEV上多个目标蛋白的潜力，本文使用11种蛋白进行了一系列DBS-Pro实验。在培养的非小细胞肺癌H1975细胞株H1975_1、H1975_2和H1975_3三个时间点的培养基中分离sev进行平行实验。测序结果显示，H1975_1、H1975_2和H1975_3的单囊泡分别为8943个、10054个和30350个。(图3A)热图显示基于log2转换后UMI总数的数据。(图3B)热图显示含有液滴的比例。(图3C)小提琴图显示了每个液滴的UMI计数分布。(图4D)表示含有至少三个蛋白的液滴前两个主成分(PCs)散点图，沿各轴表示相对样本密度，表明样本之间有很好的重叠。

Fig3

4、非小细胞肺癌患者恶性胸腔积液单个囊泡的表面蛋白谱分析

在确定DBS-Pro能够对单个sev的表面蛋白进行多重检测后，本文应用该方法对从不同肿瘤基因组改变的晚期NSCLC患者(PE002、PE009和PE011)的MPE液中收集的单个sev进行蛋白谱分析。DBS-Pro法在PE002、PE009和PE011样品中分别检测到9064、11920和4565个单囊泡。(图4A)中的热图显示了每个蛋白在DBC总数中的比例。结果表明，来自所有三种MPE样品的sEV具有相对较高的CD9表达。(图4B)显示前30个蛋白组合占条形码总数的比例。(图4C)表示所有样品的单个囊泡的UMAP降维结果，被分为了6个cluster。(图4D)堆叠柱状图显示了每个MPE样本中sEV的相对比例。(图4E) PE002、PE009和PE011样品单个囊泡的UMAP图，显示每个样品的密度。(图4F)热图显示了每个蛋白的相对表达。每一列代表一个液滴(即一个囊泡)。

Fig4

文献方法(使用的生物信息学方法)

测序FASTQs使用DBS-Pro pipeline(https://github.com/FrickTobias/DBS-Pro, v0.3)处理。从读取的每个序列中，分别使用cutadapt提取DBC和ABC+UMI组合。DBC序列通过starcode聚类进行纠错，编辑距离为2(参数' -d 2 ')。利用cutadapt与样品中使用的已知ABC序列进行比较，从每个ABC+UMI组合中确定目标(ABC)。对于每个校正的DBC和已识别的ABC，使用UMI-tools校正UMI序列。最后，对每个校正后的DBC、ABC和UMI组合的read count进行汇总。

数据过滤。首先，为了去除背景和嵌合产物，只保留有一个以上读取的UMI，过滤掉只有一个UMI的DBC。为了去除携带多个DBC的液滴，使用Jaccard索引比较了UMI序列的成对重叠。任何Jaccard索引大于0.5的DBC对都被删除。对于来自H1975细胞培养基和MPE样本的sEV，也去除了含有超过25个UMIs的DBC。从过滤的数据中生成一个计数矩阵，其中包含每个DBC和ABC的UMI数量。

使用python包matplotlib, pandas, numpy, and seaborn画图。UMAP和PCA 使用scanpy。首先，对液滴进行过滤，只保留有3个或更多蛋白的液滴。然后使用蛋白水平上的中心对数比(CLR)变换对每个样本的技术矩阵进行归一化。UMAP参数n_neighbors = 100, min_dist = 0.9, 分辨率0.6。