1. 组织固定
根据所取斑马鱼组织大小，加入20倍体积的4%多聚甲醛（PFA）固定液，4℃固定2 days。
2. 脱水
将组织使用乙醇进行梯度脱水
-30% Ethanol @1 x 5-10 mins
-50% Ethanol @1 x 5-10 mins
-70% Ethanol @1 x 5-10 mins
-100% Ethanol @s2 x 5-10 mins
3. 渗透
二甲苯或其他替代品置换组织中乙醇以便于石蜡渗入
-50% Xylene /50% Ethanol @1 x 15 mins
-75% Xylene /25% Ethanol @1 x 15 mins
-100% Xylene @1 x 15 mins
4. 包埋
请在60-65℃操作
-将组织在50%二甲苯/50%石蜡混合物中孵育60分钟，然后放入100%石蜡中孵育过夜；
-根据组织切面在一次性包埋盒中包埋并及时固定底座；石蜡凝固时间在45-60 mins。
-原位杂交蜡块存储时间＜6 months
5. 切片
-一般截面厚度为5µm，切片后，在37˚C的杂交烤箱中烘干一夜。
-通过显微镜观察是否为靶标组织或对重复切片染色确认
-原位杂交的白片保存不超过2周（RNA会随着时间的推移而降解，信号会减弱），建议4℃保存。
以下步骤除了特别说明均为室温进行
绝对不能让载玻片变干
6. 脱蜡
脱蜡前将载玻片放在60℃1小时以确保组织附着在载玻片上，并且保证在染色过程中不太可能脱落 | 脱蜡时为防止破片之间吸附进行Z字排布
Xylene @5 mins
Xylene @10 mins
100% Ethanol @5 mins
80% Ethanol @10 mins
PBST (1x PBS, 0.1% Tween 20) @5 min
7. 透化
使组织可穿透以确保mRNA可被探针、抗体和荧光团接触
-在载玻片上加入Proteinase K （7.5 µg/mL）(on slide) 孵育 @5 mins
-PBST洗 @5 mins
-Postfix in 4%PFA with 0.2% Glutaraldehyde (on slide) @20 mins
-PBST洗 @5 mins
8. 杂交
打开二级结构，呈现单核苷酸链，与探针结合
@@ 预杂交 Pre-hybridise
-将载玻片在65℃的预杂交液中杂交1 h
Formamide 25.0 mL
20 x SSC 12.5 mL
Heparin 50 μg/μL 50 μL
Yeast tRNA 50 μg/μL 500 μL
Tween-20 50 μL
DEPC水 to 50 mL
@@ 杂交 Hybridise
-将预杂交液稀释的探针加在载玻片上杂交过夜(12-16小时)。
-此步骤在湿盒中进行，通常每个载玻片加100-200 μL，探针浓度为10-20 ng/µL。
9. 洗涤
-加入65℃预热的杂交缓冲液，65℃ @1 X 10 mins; 2 X 20 mins
Formamide 25.0 mL
20 x SSC 12.5 mL
Tween 20 50 μL
DEPC水 to 50 mL
-MABT洗涤 @3 x 15mins
MABT (1L): 200 mL 5 x MAB, 1mL 100% Tween20, 799 mL DEPC water
5 X MAB: 500 mM Maleic acid, 150 mM NaCl, adjust to pH7.5 with NaOH
10. 封闭
-在载玻片上加封闭液封闭1 h
Blocking Agent: 1 x PBST，2% sheep serum (vol/vol)，2mg/ml BSA
11. 抗体孵育
-加入1：5000（0.2μL Anti-Dig-AP + 1 mL Blocking Agent:）稀释的抗体（碱性磷酸酶标记的地高辛抗体，Anti-Dig-AP），室温摇晃1 h，放于4℃过夜
12. 显色
-MABT 洗涤 @3 X 15 mins
-碱性磷酸酶底物缓冲液（AP buffer） @2 x 5 mins
1M Tris-HCl，pH9.5 5 mL
1M MgCl2 2.5 mL
4M NaCl 1.25 mL
100% Tween20 50μL
2M Tetramisol 50 µL
DEPC水 to 50 mL
-加入碱性磷酸酶底物染色液（20 μL NBT/BCTP + 1 mL AP buffer），在室温下，避光染色，每30 min镜检染色程度（体视显微镜下观察染色反应，每隔10-15分钟监测一次，直到染色饱和或达到所需的对比度），或者4℃过夜染色。
-显色完成后，加入终止液（×PBS，pH5.5；1mM EDTA；0.1% Tween20）洗涤 @3 X 5min，终止反应。
