RNA- seq 的数据处理主要分为以下几个过程：
1. 测序数据质控，以及参考基因组和注释文件下载；
2. 序列比对，将测序得到的短 reads 序列往参考基因组上 mapping；
3. 差异表达基因鉴定。
更详细的内容见软件官网
HISAT2: graph-based alignment of next generation sequencing reads to a population of genomes
一、建索引
下载参考基因组和相应的注释文件：
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
gzip -d Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
mv Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa genome.fa
wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf.gz $ gzip -d Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf.gz$ mv Homo_sapiens.GRCh38.84.gtf genome.gtf
make exon, splicesite file:
hisat2_extract_splice_sites.py genome.gtf > genome.ss
hisat2_extract_exons.py genome.gtf > genome.exon
Building indexes
hisat2-build -p 16 --exon genome.exon --ss genome.ss genome.fa genome_tran
# -p 线程数；
二、序列比对
hisat2 [options]* -x <hisat2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r> | --sra-acc <SRA accession number>} [-S <hit>] --dta
-x # The basename of the index for the reference genome.
-1 # Comma-separated list of files containing mate 1s (filename usually includes _1), e.g. -1 flyA_1.fq,flyB_1.fq.
-2 # Comma-separated list of files containing mate 2s (filename usually includes _2), e.g. -2 flyA_2.fq,flyB_2.fq.
-S # File to write SAM alignments to.
--dta # Report alignments tailored for transcript assemblers including StringTie. With this option, HISAT2 requires longer anchor lengths for de novo discovery of splice sites. This leads to fewer alignments with short-anchors, which helps transcript assemblers improve significantly in computation and memory usage.
上述 4 个参数是基本参数，如果输入文件是 FASTQ 文件，并按第一步建了索引文件，即可直接进行比对。
三、结果文件解读
hisat2 -p 8 -x $RNA_REF_INDEX -1 BB.read1.fastq.gz -2 BB.read2.fastq.gz -S ./HBR_Rep3.sam
生成的 sam 文件格式如下：
第1列：reads名称；
第2列：Flag标签；Flag标签是二进制数字之和，不同数字代表了不同的意义。Sum of all applicable flags.
1: The read is one of a pair
2: The alignment is one end of a proper paired-end alignment
4: The read has no reported alignments
8: The read is one of a pair and has no reported alignments
16: The alignment is to the reverse reference strand
32: The other mate in the paired-end alignment is aligned to the reverse reference strand
64: The read is mate 1 in a pair
128: The read is mate 2 in a pair
第3列：比对到的染色体信息；
第4列：比对到参考基因组物理位置；
第5列：比对质量值（0-60）；
第6列：CIAGR（记录插入、缺失等）；CIAGR中包含的是比对结果信息，表明了一条reads所有碱基的比对情况。比如CIGAR = 150M表示150bp的reads都比对到参考基因组上；
第7列：配对reads比对到的染色体，=表示相同；
第8列：配对reads比对到的染色体物理位置；
第9列：文库插入序列大小；
第10列：Reads序列；
第11列：质量值。
第12列：Optional fields.
四、格式转换并排序
使用 samtools 对文件进行排序
# 转换为 bam 文件格式
samtools view -S test.sam -b > test.bam
# 排序并建索引
samtools sort test.bam -o test_sort.bam
samtools index test_sort.bam
比对过程还算是比较简单，接下来就是检测差异表达基因了。
后续处理可能需要结合其它软件使用，我自己有用到的话会持续更新，欢迎翻阅写的其它笔记！
